Back(이전 화면)
효소의 응용(1)

1. 정제

◇ 정제의 목적
① 효소의 구조와 성질을 밝히는 것.
② 촉매활성이 높고, 순수한 효소.

◇ 효소의 상업화의 요건
① 효소의 공급체(미생물, 기타 동식물)입수가 쉽고 배양, 사육이 쉬워야한다.
② 재료에 목적하는 효소함량이 많이 들어 있어야 한다. 그리고 추출, 분리하기 쉬운 형태로 존재하는 것이어야 한다.
③ 정제방법이 쉬워야 한다.
④ 정제 전, 후에 안정해야 한다.
⑤ 비용이 적게 들어야 한다.

1. 효소의 안정성
- 분리, 농축, 보존과정 중에 활성유지
- 효소는 살아있는 물질이므로 상태를 유지시켜야 한다.

A. 안정화 조건

① 온도 : 0℃ 부근 (0℃∼5℃에서 조작)
- 보존은 -20℃이하에서 한다. (glycerol이 50% 들어가 있는 상태에서 -20℃로 온도를 내려도 얼지 않음. 동결건조해서 분말상태로 보관.

② pH
ⅰ) 대부분 중성 pH 6-8
- 안정 pH 와 최적 pH는 같지않음.(같은 경우도 있음)
ⅱ) 완충용액
- KH2PO4/K2HPO4
- NaH2PO4/Na2HPO4
- pH = pKa" = 7.21 ([H2PO4-] = [HPO42-])
예) orgranelle(세포 기관) 존재하는 식물효소: Tris-HCl에서 불안정하나 TES에서 안정
TrisㆍHCl = N-tris(hydroxymetyl)amino methane = THAM (0.1M 용액의 pH = 10.4)
TES = N-tri(hydroxymethyl)methyl amino 1-ethanesulfonic acid
③ HEPES: 4(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (pKa' = 3, pKa" = 7.55, 20℃)
ⅲ) 염의 농도
- NaCl, KCl

B. 안정화제

① 환원제
- thiol(-SH)기 관련효소(산화방지제)
- 2-mercaptoethanol : HSCH2CH2OH
- DTT (dithithreitol) : HSCH2(CHOH)2CH2SH
- ascorbic acid (Vitamin C)
- glutathione : L - glu - L - Cys - gly * 환원제 역할(-SH)
※가수분해 효소 : 환원제 넣으면 안 된다.
- 공기산화에 민감한 효소 : 질소가스 속에서 정제

② polyol 류 (다가알코올류) : alcohol기가 많이 있는 것.
- Glycerol (10-50%)
- 설탕(sucrose, glucose-fructose)
- ethylene glycol: HOCH2CH2OH (10%)
- 포도당 (glucose)
- sorbitol(glucitol)
mannitol

③ 금속이온 및 chelate 시약

◇ 금속이온 첨가
ㆍ Mg2+, Mn2+ : 식물 glutamate synthase를 안정화
ㆍ Ca2+ : amylase를 활성화 또는 안정화

◇ 금속 이온 제거
ㆍ EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid
ㆍ EGTA: ethylene glycol bis(β-aminoethylether) NNN'N'tetraacetic acid
※ 보통 EDTAㆍ2Na를 이용

④ 기질 , 보조효소 , allosteric effector

⑤ 유기용매 : DMSO(dimethylsulfoxide)

⑥ protease 저해제
- 선택적 저해제
PMSF : phenylmethyl-sulfonylfluoride (serine protease 저해)
ㆍDFP : Diisopropylfluorophosphate (serine protease 저해)

⑦ 단백질
BSA (bovine serum albumin) : 소혈청 알부민, 식물 nitrate reductase, 돼지췌장 amylase, 토끼근육 aldolase dehydrogenase

C. 저분자 물질의 제거
- 분리전에 없앤다. 주로 식물에 이용.
ㆍ tannin : 감의 떨떠름한 맛 성분
chlorogenic acid
ㆍ gel chromatography 로 제거

2. 효소의 생산

◇ 미생물 효소가 주로 사용되는 이유
① 비교적 간단한 설비와 싼원료를 사용하여 단시간에 대량의 효소생산 가능.
② 인공 변이주나 유전자 조작으로 필요한 효소의 생산성 향상이 가능.
③ 미생물이 생산하는 효소가 다양.
④ 적응 현상을 이용하여 목적하는 거의 모든 유용 효소의 획득이 가능.

◇ 미생물 생산 효소의 특징
① 당결합 효소가 없다.
② -S-S-결합이 없다.
※ mammalian protein은 당이 부가되어야 효소로 활성을 가진다.
- 따라서 당을 부가하기 위해서 동물유전자 분리 → 식물에 도입 → 효소생산 → 효소분리 정제

3.효소의 분리 추출

1) Homogenizer
- 핵, 미토콘드리아, microsome 분리용이.

2) Blender : Waring blender
- 수천 rpm (rotation per min) : 2분정도

3) 초음파 처리법 : tip type, box type
- 미생물 세포파괴 , 과립 중 존재효소.
- 10-600kc/sec : 냉각 필요

4) 가압법
- 900 psi 이상 압력, 순식간에 가하거나 20,000 psi 로 작은 nozzle 에어 분출
- 저온에서 조작

5) 뢰계법
- 유리분말, 알루미늄이나 sea sand
- 작은 강철공, glass beads

6) 자가소화법
- 자기 용해력 유도, 효소 가용화
- ethylacetate, toluene 처리: 분해효소 작용-->구조단백질, 지질파괴-->결합효소 가용화
- 효모에 이용

7) 효소 처리법
- 세포벽 분해효소
ㆍ미생물 : lysozyme, glucanase
ㆍ식물 : cellulase, hemicellulase

8) 삼투압차법
- 내염성, 호염성 세균
- 적혈구
- 황산암모늄, 황산나트륨

9) 동결 융해법
- 얼음, 소금, dryice
- dryice-acetone, dryice-ethanol

10) 화학적 추출법
- 0.25N H2SO4, 0.15M NaCl
- 계면활성제: SDS(sodiumdodecyl sulfate, sodium lauryl sulfate, 1-3%), Triton X-100(0.5-1%)
- chelate계: EDTA


4. 농 축

1) 진공 건조
- 감압이하 (vacuum 상태)
- flask evaporator, 판형농축기 (가열) : 용매성분 잘 날라감
※동결건조 (lyzophilizer)
- (용액 자체를 -20℃이하로 얼려서 vacuum 상태로 건조해서 빼냄)
- 얼린 시료를 진공상태에서 건조
- 단점 : 다른물질(base 류, 협잡물)까지 같이 농축

2) 침전법에 의한 농축
- (NH4)2SO4등에 의한 염석법 : 분획 정제의 효과
※쉽게 용액 상태에서 단백질을 침전시키는 방법
→ 탈염조작 필요(염제거) : gel filtration chromatography 이용

3) 흡착법에 의한 농축
-이온교환수지, 이온교환 cellulose, hydroxy apatite, alumina 이용
→ 단백질 흡착 후 고농도의 염용액으로 농축

4) 투석과 한외여과
- 투석 : cellophan 막, collidone 막에 대한 투석
- 한외여과막(cellulose 유도체나 합성 polymer)이용

5) gel 여과(filtration)
- 가교 dextran (Sephadex), polyacrylamide, agarose
※ 다공성 수지 : molecular sieve (분자체)역할

5. 정제

1) 선택적 불활성을 이용한 정제
- 효소는 종류에 따라서 온도, pH, 금속이온에 대한 안정성이 다르다.
⇒ 목적 효소의 안정 범위 내에서 비목적효소나 협잡물을 열처리, 산알카리처리, 금속이온 처리로 선택적으로 변성시켜 제거가능.
예) 감자의 단백질 분해효소 억제제 : 80℃, pH 2.0에서도 활성을 띤다.

2) 용해도를 이용한 정제
① 산을 이용한 변성 : pepsin은 산에서 변성되지 않는다. 다른것들은 변성된다.
② 알카리 변성 : 다른 단백질을 변성 - 응고 또는 제거
③ 열에 의한 변성 : 열에 강한것만 선택적으로 분리
④ 용매의 변성

3) 등전점의 차를 이용
- isoelectric point (pI) : 아미노산의 총하전(net charge)이 0이 되는 pH, 전기적으로 중성, 전장에서 이동하지 않는 pH
- pI = (pKa1 + pKa2)/2, pKa가 3개인 경우는 우세한 2개의 평균 값
- 예, glycine의 pI = (2.4 + 9.6)/2 = 6.0 lysine의 pI = (8.9 + 10.5)/2 = 9.7 (pKa1 = 2.2)

4) 이온교환 크로마토그래피 : 용액의 pH에 따라 +,- charge를 달리띤다.
CM(carboxymethyl, -O-CH2-COOH) cellulose : - charge를 가지므로 + charge를 함유하는 단백질이 결합되어 분리가능(양이온교환기)
DEAE(diethylaminoethyl, -CH2CH2N(CH2CH3)2 cellulose : + charge를 가지므로 - charge를 함유하는 단백질이 결합되어 분리가능(음이온교환기)

5) gel chromatography
- 가교 dextran (Sephadex), polyacrylamide, agarose
※다공성 수지:molecular sieve (분자체)역할
- 작은 분자량의 물질은 gel 구멍 속으로 들어갔다 나오느라 유출 속도가 늦고 큰 분자량의 물질은 gel 사이 간격으로 나오므로 유출 속도가 빠르다.

6) 친화 크로마토그래피:
- 생체기능에 의한 특이적 친화력
- Ligand : 항체, 보효소, 기질, 생산물

7) 소수성 크로마토그래피 : 소수결합
- 흡착 크로마토그래피 : 소수결합, van der Waals 인력

8) 역상(reverse phase) 크로마토그래피 : solid phase가 nonpolar이고 mobile phase가 polar인 경우로 polar한 생물질 분리에 이용됨. 액-액 분배
- Normal phase chromatography: solid phase가 polar이고 mobile phase가 organic, non polar solvent인 경우로 non polar 물질 분리에 이용.

9) 기타 방법
- HPLC(high performance liquid chromatography) : 고압, 고속으로 단백질 분리
- sample 주입시 펌프 ⇒ 칼럼 ⇒ 검출기 ⇒ 분취기를 통과하여 단백질을 분리
- 결정화 : 효소는 동일한 구조를 갖는 동일 효소끼리 결정화한다.
- 순수 분리한 효소를 저농도(4, 12, 16(w/w)%)의 polyethylene glycol(PEG);-->고농도(16, 20%) PEG로 바꿔 결정을 만든다.
- Hanging drop method외에 sitting drop, dialysis, seeding, batch, free capillary diffusion, temperature gradient method가 있다.

※ X-ray crystallography : X선 회절법을 이용하여 분자구조를 결정
- X-ray의 파장에 따라 분자구조 분해능이 달라짐.

X-ray 파장 분해능
4.6 옹스트롬 단백질 분자의 전반적 형태
3.5 옹스트롬 polypeptide 사슬
3.0 옹스트롬 아미노산의 측면 사슬 순서
1.5 옹스트롬 원자들의 위치

2. 유전공학